基本培養(yǎng)條件:

培養(yǎng)基：90％DMEM +10％胎牛血清

溫度：         37℃

         氣相：95％空氣，5%二氧化碳

2.細(xì)胞運(yùn)輸：

本細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，常規(guī)運(yùn)輸方式是將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至狀態(tài)良好后灌滿新鮮的培養(yǎng)液并封好瓶口進(jìn)行運(yùn)輸。

根據(jù)氣溫的高低及運(yùn)輸距離的遠(yuǎn)近，我們可能采取以下兩種方式運(yùn)輸。

活細(xì)胞YM消化離心后血清發(fā)貨；

凍存管發(fā)貨。

3.客戶收到細(xì)胞后請(qǐng)嚴(yán)格按照以下要求進(jìn)行操作。

3.1培養(yǎng)前的注意事項(xiàng)：
A. 細(xì)胞出庫前都是生長(zhǎng)良好,我們會(huì)對(duì)出庫細(xì)胞進(jìn)行拍照留檔(建議用戶在收到細(xì)胞時(shí)拍照片,細(xì)胞拍照時(shí)請(qǐng)用100X 、200X倍數(shù)各拍上2~3張照片留存,可用作細(xì)胞狀態(tài)的對(duì)比,拍攝的照片應(yīng)當(dāng)清晰)。

B. 用戶在收到細(xì)胞后,先觀察培養(yǎng)瓶是否完好,培養(yǎng)液是否外滲,培養(yǎng)液是否渾濁。

3.2新購細(xì)胞的初步培養(yǎng)：

客戶收到細(xì)胞后在未開封前,先用75％酒精將培養(yǎng)瓶外表擦拭干凈,鏡檢細(xì)胞貼壁情況。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行1-2小時(shí)的緩沖，待細(xì)胞恢復(fù)基本生長(zhǎng)狀態(tài)后，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞恢復(fù)基本生長(zhǎng)狀態(tài)后，倒置顯微鏡下觀察整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況：

A. 細(xì)胞密度未達(dá)85％時(shí)，用75％酒精噴灑培養(yǎng)瓶后放在生物操作臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸取剩余培養(yǎng)液，只留6~8ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

B.細(xì)胞長(zhǎng)滿（達(dá)85-95％），即可進(jìn)行傳代。

3.3細(xì)胞培養(yǎng)：

A.細(xì)胞密度未達(dá)85％時(shí)，5~8ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

B.培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)耗盡時(shí)，需及時(shí)換新鮮培養(yǎng)基；

C.細(xì)胞長(zhǎng)滿（達(dá)85-95％），即可進(jìn)行傳代。

傳代參考步驟如下：

a.棄去培養(yǎng)液，用無鈣鎂D-PBS洗滌1-2次

對(duì)于T25培養(yǎng)瓶來說，加入2-3ml 0.25%的YM-EDTA消化液，置b.37℃消化，并不時(shí)用顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，如細(xì)胞回鎖變圓、透亮、輕拍瓶壁呈流沙樣脫落，則迅速回操作臺(tái)，加入6-8ml含10％血清的培養(yǎng)液，終止消化并輕輕吹打細(xì)胞，使其變成單細(xì)胞懸液。

將細(xì)胞收集于離心管中以c. 80g-120g離心力離心2-5min，棄上清 , 輕彈管底 , 將細(xì)胞混懸于殘留上清中。

d.加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代、凍存；

e.如果沒有特別說明，收到的細(xì)胞第一次傳代比例為1:2，后期可按1：4-1：6的比例傳代。

3.4細(xì)胞觀察：

A、觀察細(xì)胞密度做好用（4X物鏡）低倍鏡觀察，以便正確的判斷細(xì)胞密度細(xì)胞。

B、觀察細(xì)胞形態(tài)請(qǐng)用（10X或20X）高倍鏡觀察。

3.5細(xì)胞保存：

凍存配方：70％基礎(chǔ)培養(yǎng)液+20％胎牛血清+10％DMSO

保存條件：液氮保存

3.6注意事項(xiàng)：

A、瓶中運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)液我們建議保留培養(yǎng)一代后，傳代后分別用客戶自己的培養(yǎng)基和運(yùn)輸培養(yǎng)基分別培養(yǎng)一瓶。以防止細(xì)胞不適應(yīng)客戶自用的培養(yǎng)基而造成狀態(tài)不好或細(xì)胞死亡。

B、如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁不牢，有少量脫落，可離心運(yùn)輸用培養(yǎng)基，將細(xì)胞離心下來，混懸后接種到原瓶?jī)?nèi)；